Evaluation of the role of sphingomyelin pathway in glucose induced hepatic steatosis and cell death

تتميز الدهون الكبدية (التنكس الدهني الكبدي) بزيادة محتوى الدهون داخل الخلايا الكبدية (HCLs)، وغالبًا ما تُلاحظ هذه الحالة في حالات مقاومة الإنسولين كما هو الحال في مرض السكري من النوع الثاني (T2DM). ويُعتقد أن الزيادة في الأحماض الدهنية الحرة الغذائية في بلازما الأفراد المصابين بالسكري تُسهم بشكل كبير في تراكم الدهون داخل الخلايا الكبدية. ومن المعروف أن التراكم السامّ للدهون (lipotoxicity) داخل الخلايا الكبدية، إلى جانب اختلال التوازن في البيئة الالتهابية، يشكلان معًا أحد الأسباب الرئيسية لمقاومة الإنسولين. خلال بداية تطور مرض السكري، يرتبط الالتهاب الاستقلابي بظهور أمراض مثل مقاومة الإنسولين، والسكري من النوع الثاني، ومرض الكبد الدهني. ومع ذلك، لا تزال المسارات التي تُسهم في تطور التنكس الدهني الكبدي وتؤدي إلى موت الخلايا أثناء الإصابة بالسكري غير مفهومة بالكامل. وقد برزت السفينغوليپيدات النشطة بيولوجيًا (Bioactive sphingolipids) كمجموعة من الجزيئات التنظيمية الهامة التي تتحكم في طيف واسع من العمليات الخلوية، بما في ذلك المناعة والتوازن الداخلي للدهون بين الخلايا. ويُعتبر السيراميد (Ceramide) الجزيء المركزي في أيض السفينغوليپيدات، إذ ينظم العمليات المرتبطة بالموت الخلوي المبرمج (apoptosis) والتكاثر الخلوي. تُحفَّز عملية تحلل السفينغوميالين (Sphingomyelin) عبر إنزيمات السفينغومياليناز (SMases)، وتُعد هذه العملية من المسارات الرئيسية لإنتاج السيراميد استجابةً للإجهاد الخلوي. يقوم إنزيم السفينغومياليناز-2 المحايد (nSMase2) بتحفيز تحويل السفينغوميالين إلى السيراميد والفوسفاتيديل كولين على الجانب السيتوسولي من الغشاء البلازمي، ويُعدّ بذلك مرشحًا قويًا للمساهمة في إنتاج السيتوكينات من خلال إنتاج السيراميد. وقد أثبتت أبحاث مخبرنا سابقًا أن تنشيط nSMase2 هو جزء من الاستجابة للسيتوكين عامل نخر الورم ألفا (TNF-α)، والذي يُعد أحد السيتوكينات الرئيسية المرتبطة بمرض السكري. وتشير الأدلة إلى أن لـ nSMase2 دورًا غير مباشر في تراكم الدهون في الكبد، إذ أن تثبيط تخليق السيراميد من المسار الجديد (de novo synthesis) يؤدي إلى تقليل تراكم الدهون الكبدية في نماذج الفئران المصابة بمرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD). ومع ذلك، لا يزال الدور المحدد لـ nSMase2 في تراكم الدهون الكبدية المرتبط بالسكري غير واضح. لذا، نفترض أن هذا الإنزيم يُشارك في تعزيز تراكم الدهون، والالتهاب الاستقلابي، وموت الخلايا في الخلايا الكبدية. هدف الدراسة هو تحديد دور إنزيمات السفينغومياليناز (SMases) في تحفيز السمية الدهنية وموت الخلايا تحت ظروف فرط السكر. السؤال البحثي الأساسي: هل تلعب إنزيمات SMase (SMPD1، SMPD2، أو SMPD3) دورًا في تنظيم تراكم الدهون وموت الخلايا في الخلايا الكبدية؟ وإذا كان الأمر كذلك، فما هي الآليات المتورطة؟وفقًا لمسار الإشارة الغشائي لإنزيم SMase، يتم إنتاج السيراميد من خلال تحلل السفينغوميالين في أغشية الخلايا بواسطة nSMase2. بالإضافة إلى تخليق السيراميد من المسار الجديد، فإن الالتهاب يعزز أيضًا نشاط nSMase2، في حين أن نقص هذا الإنزيم أو تثبيطه باستخدام المركب GW4869 يؤدي إلى تقليل الاستجابات الالتهابية في النماذج الحية (in vivo) والخلايا المعزولة (in vitro). وقد أظهرت دراسات أن السيراميدات تلعب دورًا في الإصابة بالتنكس الدهني الكبدي، إذ تم رصد زيادة في تركيزات السيراميد في أكباد الفئران المصابة بالسمنة والتنكس الدهني. وفي المقابل، أدى تثبيط تخليق السيراميد إلى تقليل حدة التنكس الدهني، والتليف، وتراكم الدهون الكبيرة داخل الخلايا، كما قلل من محتوى ثلاثي الغليسريد في الكبد. استنادًا إلى هذه الأدلة، ندعم فرضيتنا القائلة بأن nSMase2 قد يلعب دورًا محوريًا في تنظيم تراكم الدهون، والالتهاب، وموت الخلايا في الخلايا الكبدية. البيانات الأولية: تشير بياناتنا الأولية إلى أن nSMase2 يُظهر زيادة في التعبير في خلايا HepG2 المزروعة تحت ظروف فرط السكر. وقد ارتبط هذا الارتفاع في التعبير بزيادة في موت الخلايا عبر مسار الموت المبرمج (Apoptosis). كما أن تثبيط نشاط nSMase2 باستخدام المركب GW4869 أدى إلى تقليل معدل موت الخلايا، في حين أن استخدام محفّز الإنزيم (DNR) أدى إلى زيادة ملحوظة في بقاء الخلايا. الأهمية: تشير نتائجنا إلى أن nSMase2 قد يلعب دورًا رئيسيًا في تنظيم حيوية الخلايا الكبدية تحت ظروف ارتفاع الجلوكوز، مما يجعله هدفًا علاجيًا محتملًا لعلاج التنكس الدهني الكبدي المرتبط بمرض السكري.

Hepatic steatosis is characterized by the increased content of the hepatocellular lipids (HCLs) and is frequently observed in insulin-resistant states as seen in type 2 diabetes mellitus (T2DM). The excess of dietary free fatty acids in the plasma of diabetic individuals, is believed to significantly contribute to HCL accumulation. It is known that the lipotoxic accumulation of HCL in hepatocytes along with the imbalance of pro-inflammatory milieu account for insulin resistance. During the onset of diabetes, metabolic inflammation is associated with diseases including insulin resistance, type 2 diabetes and fatty liver disease. However, the pathways that promote hepatic steatosis and trigger cell death during diabetes remain unclear. Bioactive sphingolipids have emerged as key signaling molecules that regulate a diverse range of cellular processes that are important not only in immunity but also intercellular lipid homeostasis. Ceramide is considered as the central molecule in sphingolipid metabolism which regulates both pro-apoptotic and anti-proliferative processes. Sphingomyelin (SM) hydrolysis is catalyzed by sphingomyelinases (SMases) and it is considered a major pathway for stress-induced ceramide production. The activity of neutral sphingomyelinase-2 (nSMase2) catalyze the conversion of SM to ceramide and phosphocholine at the cytosolic leaflet of plasma membrane (PM). Therefore, nSMase2 is considered to be a strong candidate for producing cytokines through ceramide production. The activation of nSMase-2 was established previously by our lab to be a part of the response of TNF (tumor necrosis factor)-α, a major diabetes related cytokine. The nSMase2 may have an indirect role in lipid accumulation in the liver as the inhibition of ceramide de novo synthesis has been shown to reduce hepatic lipid accumulation in rats with NAFLD. However, little is known about the role of nSMase2 in diabetes related-HCL. Therefore, we hypothesize that this enzyme participates in promoting lipids accumulation, metabolic inflammation, and cell death in hepatic cells. Our goal is to identify the role of SMases in triggering lipotoxicity and cell death under high glucose conditions. Central query: Do SMases (SMPD1, SMPD2 or SMPD3) play a role in regulating lipid accumulation in hepatocytes and cell death; if so, what mechanisms are involved? In reference to SMase transmembrane signaling pathway, ceramide is generated during hydrolysis of sphingomyelin in the cell membranes by nSMase2. In addition to de novo ceramide synthesis, inflammation also upregulates the activity of nSMase2 (3) whereas, nSMase2 deficiency or inhibition by GW4869 alleviates inflammatory responses in vivo (4) and in vitro (5). Ceramides have also been shown to be involved in hepatic steatosis as obese mice with hepatic steatosis were reported to have increased hepatic concentrations of ceramides (6), while, inhibiting de novo ceramide synthesis attenuated the hepatic steatosis, fibrosis, macrovesicular fat accumulation and reduced hepatic triglyceride content (7). Taken together, these evidences establish premise and support our hypothesis that nSMase2 could play a role in regulating lipid accumulation, inflammation, and cell death in the hepatocytes. Preliminary data: Our primary data indicate that nSMase-2 is upregulated in HepG2 cells cultured under hyperglycemic stress conditions. This upregulation was found to be associated with increased cell death by apoptosis. Blocking nSMase-2 enzyme by its inhibitor (GW4869) reduced the cell death while treatment with its agonist (DNR) dramatically increased cell viability. Significance: Our results suggest that nSMase2 may play a major role in regulating the viability of hepatic cells under high glucose conditions. This will provide a potential therapeutic target to treat diabetes-related hepatic steatosis.