Effect of Oxidative Stress on TLR4/IRF5 Expression and Signaling Modulations in Macrophages and Adipocytes

تشهد معدلات انتشار السمنة ومرض السكري من النوع الثاني (T2D) تزايدًا ملحوظًا على مستوى العالم، بما في ذلك في دولة الكويت. وينتج عن التوازن الإيجابي للطاقة – بسبب الإفراط في تناول الأغذية عالية السعرات الحرارية مع نمط الحياة الخامل – تخزين الطاقة الزائدة على شكل ثلاثي الغليسريدات في النسيج الدهني الأبيض. يتكوّن هذا النسيج بشكل رئيسي من الخلايا الشحمية والخلايا المناعية. في حالات السمنة، تؤدي التغيرات المناعية-الاستقلابية في النسيج الدهني الأبيض إلى اختلال الاتزان الداخلي (الهميوستاز) وظهور حالة من الالتهاب المزمن منخفض الدرجة تُعرف باسم "الالتهاب الاستقلابي". ومن الجدير بالذكر أن زيادة النشاط الاستقلابي/متطلبات الطاقة في النسيج الدهني المتوسع مع مرور الوقت تستدعي حدوث تكوّن أوعية دموية جديدة (neovascularization) لتلبية الحاجة المتزايدة من الأوكسجين والعناصر الغذائية. وخلال هذه المرحلة، تنشأ حالة من الإجهاد التأكسدي ضمن البيئة المجهرية للنسيج الدهني. تُظهر بياناتنا الأولية زيادة في تعبير مستقبلات التول الشبيهة TLRs-2/4/8/10 ومنظم الإجهاد IRF5 في النسيج الدهني البشري المصاب بالسمنة/السكري من النوع الثاني، وهي تغيّرات تتناسب طرديًا مع مؤشر كتلة الجسم (BMI). ومن ثم، نفترض أن الإجهاد التأكسدي يمكن أن يحفّز/يعزز من تعبير TLR4 وIRF5 في كل من الخلايا البالعة (الماكروفاجات) والخلايا الشحمية، وهما من أبرز الخلايا المحورية في الأنسجة الدهنية. في هذه الدراسة، ستُعرّض الخلايا البشرية والفأرية لحالة من الإجهاد التأكسدي باستخدام بيروكسيد الهيدروجين (H₂O₂) و/أو نقص الأوكسجين بنسبة 3% (hypoxia) لتحفيز إنتاج أنواع الأوكسجين التفاعلية (ROS). وسيتم تقييم تحفيز ROS باستخدام صبغة DCFH-DA ونشاط إنزيم سوبر أوكسيد ديسميوتاز (SOD)، في حين ستُستخدم اختبارات استبعاد الصبغة و/أو اختبار MTT لتحديد التأثيرات السمية الخلوية. كما ستُقاس تغيّرات التعبير في TLR4 وIRF5 على مستوى الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) والبروتين باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الزمن الحقيقي (RT-PCR) وقياس التدفق الخلوي (flow cytometry)، أو المجهر الليزري الكُسيري (confocal microscopy) وتقنية التوصيف الغربي (Western blotting). كما سيتم قياس الاستجابات الإفرازية باستخدام اختبارات متعددة لمجموعة السيتوكينات/الكيموكينات (Multiplex assays). وسيُستخدم تداخل الحمض النووي الريبوزي الصغير (siRNA) لتثبيط تعبير TLR4 وIRF5 في الخلايا الشحمية والماكروفاجات، في حين سيتم استخدام مثبطات المسارات لتحديد آليات الإشارة المتورطة. أما الوظائف الاستقلابية فسيتم تقييمها باستخدام اختبارات امتصاص الغلوكوز. ستُحلل البيانات (المتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط SEM) باستخدام اختبار (t-test)، وتحليل التباين (ANOVA)، وتحليل الارتباط لبيرسون، وتحليلات متعددة المتغيرات بحسب ما يلزم. ستُساهم المعلومات المُكتسبة في سدّ الفجوات المعرفية، وتحديد أهداف ذات قيمة تنبؤية أو علاجية، وتمهيد الطريق لإجراء دراسات مستقبلية باستخدام نماذج حية (in vivo).

Human obesity/type-2 diabetes (T2D) prevalence is escalating globally, and in Kuwait as well. A positive energy balance due to high-caloric food-intake with sedentary lifestyle result in storage of superfluous energy as triglycerides in the white adipose tissue. The white adipose tissue mainly comprises of adipocytes and immune cells. In obesity, immunometabolic changes in white adipose tissue disrupt the homeostasis and lead to chronic low-grade inflammation called metabolic inflammation. Notably, enhanced metabolic activity/energy demand in the expanding adipose tissue require neovascularization over time to compensate needs for additional oxygen and nutrients. During this time, a state of oxidative stress is established within the adipose microenvironment. Our preliminary data show increased expression of TLRs-2/4/8/10 and stress regulator IRF5 in human adipose tissue in obesity/T2D; changes correlating with BMI. We, therefore, hypothesize that oxidative stress can induce/promote TLR4/IRF5 expression in macrophages and adipocytes – two most critical players in the fat. In this study, human/mouse cells will be subjected to oxidative stress by H2O2 and/or 3%O2 hypoxia to induce reactive oxygen species (ROS). ROS induction will be assessed by DCFH-DA staining and super oxide dismutase (SOD) activity while cytotoxic effects will be determined using dye-exclusion and/or MTT assays. Expression changes in TLR4/IRF5 will be measured at both mRNA and protein levels using real-time RT-PCR and flow cytometry (or confocal microscopy, western blotting), respectively. Multiplex cytokines/chemokines assays will be used to measure secretory responses. TLR4/IRF5 siRNAs will be transfected for target gene suppression in macrophages/adipocytes while pathways’ inhibitors will be used to identify the signaling mechanism(s) involved. Effects on metabolic function will be assessed using glucose uptake assays. Data (mean±SEM) will be analyzed using t-test, ANOVA, Pearson’s correlation, and multivariate analyses as appropriate. The information gained will fill gaps in knowledge, help identify target(s) of predictive/therapeutic significance and pave way for in vivo model studies.